脊髓性肌萎縮癥（spinalmuscularatrophy，SMA）是一種常染色體隱性遺傳病，居兒童致死性常染色體隱性遺傳病的第2位。位于染色體5q11.2～q13.3上的運動神經元存活基因（Survivalmotorneuron，SMN）是SMA的主要致病基因。

　　人基因組有兩個緊鄰的高度同源的SMN基因：端粒側的SMN1和著絲粒側的SMN2，兩者僅有5個堿基不同。SMN1是主要功能基因，該基因突變可導致SMA發病，SMN2為臨床表型的調節基因，影響病情的嚴重程度，其拷貝數增加可減輕SMA表型。目前已知約94％的SMA患者為SMN1基因第7和（或）第8外顯子純合缺失所致，少數病例可由SMN1基因點突變或小的缺失引起。

　　SMN1基因外顯子缺失檢測的意義

　　SMA在人群中的發病率為1/5000～1/10000，群體攜帶者頻率為1/35～1/50，是出生缺陷的高危因素，因此極有必要進行SMA攜帶者的人群篩查，并通過產前診斷技術降低人群中SMA患兒的出生率。

　　臨床上將SMA分為Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型，即嬰兒型、中間型和少年型，嚴重程度依次遞減。神經專科醫生一般根據患者發病年齡、臨床表現及病情進展程度進行臨床診斷，輔助檢查方法包括肌電圖、肌酶和肌肉活檢，結合家族史和SMN1基因分析可進行確診。由于SMA患兒中約94%為SMN1基因外顯子純合缺失，因此，SMN1基因缺失檢測對于SMA的診斷具有更高的靈敏度和特異性。且對不同型的SMA患者，SMN1純合缺失率沒有顯著差異，所以，SMN1純合缺失的檢測對于不同型SMA患者具有相同的臨床診斷價值。在歐美人群中，SMN1基因純合缺失檢測已成為診斷和排除診斷SMA的首選方法。

　　SMN1基因缺失檢測試劑的現狀

　　目前，SMN1基因外顯子缺失檢測試劑較為缺乏，臨床檢驗實驗室較為公認的方法是PCR結合限制性片段長度多態性（PCR-RFLP）的方法。但該方法操作較為繁瑣，且重復性差，不利于標準化，不易推廣。同時，這種方法只能檢測出純合缺失，無法確認雜合缺失。

　　荷蘭的SMAMLPA檢測試劑可對待測靶序列進行半定量分析，因此既可檢測純合缺失，亦可確認雜合缺失。在國內外已有多篇文獻報道采用該方法進行SMA患者診斷和SMA攜帶者篩查。但該產品目前仍為“僅用于研究”的試劑，尚未按照體外診斷類醫療器械上市（98/79/EC）。

　　2015年底，原國家食品藥品監管總局批準了第一項SMN1缺失突變檢測試劑上市。該產品采用多重實時熒光MGB-TaqMan探針PCR法，以人基因組單拷貝基因RPP40為內參基因，對SMN1基因第7外顯子和第8外顯子拷貝數進行相對定量檢測，用于SMA患者的體外輔助分子診斷。SMN1基因外顯子缺失檢測的難點之一在于排除高同源性基因SMN2的干擾，特別是對于SMN2高拷貝數的受試者，需保證結果的準確可靠。該產品通過對實時熒光PCR相對定量、絕對定量技術進行系統整合，并在反應體系中加入特定化學組分，以抑制PCR引物3’端的胞嘧啶（C）與胸腺嘧啶（T）的錯配，增加PCR擴增的特異性，從而有效控制SMN2基因非特異性擴增對檢測結果的影響，準確檢出高拷貝數SMN2樣本中SMN1基因第7和第8外顯子的缺失情況。

　　鑒于國內外尚無任何按照體外診斷試劑批準上市的SMA分子診斷產品，因此臨床試驗方案中依據EMQN關于《SMA分子診斷最佳實踐指南》，采用了國內外SMA體外輔助分子診斷領域公認的PCR-RFLP法作為對照方法。臨床試驗共完成1069例，其中正常對照組777例，SMA病例組292例，統計分析結果顯示申報產品與對比方法檢測結果的一致性為100%（95%置信區間：99.66%～100%）。此外，9747例正常成年人大樣本中目標外顯子△△Ct分布范圍的調查亦顯示，該產品的純合突變判斷界值設置合理。

　　該試劑目前批準的預期用途僅包含純合缺失的檢測，尚不能用于雜合缺失的檢測，因此無法用于SMA攜帶者的篩查，這是該產品的缺陷之一。

　　事實上，該產品在設計上已考慮到SMA攜帶者的檢測，其檢測原理是以待測樣本中目標外顯子熒光信號Ct值與內參基因熒光信號Ct值之差（△Ct_s），與正常對照品三個梯度稀釋品中目標外顯子熒光信號Ct值和內參基因熒光信號Ct值之差的平均值（△Ct_a）之差，即△△Ct，作為待測樣本中目標外顯子拷貝數檢測變量（△△Ct=△Ct_s-△Ct_a）。根據實時熒光定量PCR相對定量的基本數學原理推導得到申報產品檢測變量△△Ct的計算公式，依據這一計算公式可推導出純合缺失、雜合缺失和野生型的△△Ct理論值（或范圍）；再結合目標外顯子與內參基因擴增效率差異以及SMN2不同拷貝數的影響，可對上述△△Ct理論值進行優化。結果顯示純合缺失、雜合缺失和野生型的△△Ct值（或范圍）之間可設置合理的判斷界值，因此理論上該產品可分別檢測出三種基因狀態。但鑒于生產企業對雜合缺失與野生型之間的判斷界值研究尚不透徹，再加上缺乏可判定雜合缺失的對比方法等其他困難，本次注冊申請的預期用途僅限于檢測純合突變，即SMA患者輔助診斷。

　　綜上，SMN1基因外顯子缺失檢測在SMA疾病診斷和SMA攜帶者篩查中具有重要的臨床價值。然而到目前為止，受到技術水平的限制，相關的體外診斷試劑比較缺乏，特別是可用于SMA攜帶者篩查的雜合缺失檢測，尚無適合的體外診斷試劑上市。（器審中心審評六部  何靜云）